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Comparacion de tres metodos para la determinacion de microalbuminuria .1 - Parte2

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Índice de Artículos
Comparacion de tres metodos para la determinacion de microalbuminuria .1
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Actualmente se encuentran en el mercado diversos métodos para determinar una amplia gama de parámetros de gran importancia, como la microalbuminuria; entre estos métodos, algunos proporcionan resultados cuantitativos, tales como el radioinmunoensayo, la nefelometría, la turbidimetría y la inmunodifusión radial; también se encuentran otros métodos que brindan resultados rápidos y de manera semicuantitativa como lo son las tiras reactivas que se emplean específicamente para la valoración de la microalbuminuria.

El principal factor en la evaluación de métodos lo constituye el conjunto de sus especificaciones analíticas. Esta capacidad se expresa como precisión, sesgo, exactitud, linealidad, límite de detección, intervalo de medición, sensibilidad analítica, especificidad (si corresponde). Dicha información la provee el fabricante, pero se debe verificar el grado en que esas especificaciones se cumplen en el laboratorio. Es decir, verificar las prestaciones reales en las condiciones de trabajo del laboratorio. (11)

La detección de la microalbuminuria debería ser un examen de rutina en Venezuela, tal como ocurre en países desarrollados, debido a que éste es un parámetro de gran utilidad para la detección del daño renal incipiente en etapas en las que no existe aún evidencia clínica. Además, es utilizado para evaluar la progresión de enfermedades como diabetes e hipertensión arterial. La detección de microalbuminuria puede funcionar como método de diagnóstico o control de las patologías antes mencionadas, ya que es un método útil, sencillo y eficaz.

En esta investigación se pretende brindar una visión más detallada sobre el comportamiento de estos métodos de detección, de modo que el analista pueda dar garantía que los resultados obtenidos a través de ellos son exactos y revelan el verdadero estado del paciente; del mismo modo se busca conocer cuál de estas técnicas desde el punto de vista coste-beneficio es la más idónea para la determinación de microalbuminuria en aquellos pacientes que tienen riesgo de presentar daño renal.

En Venezuela, la determinación de la microalbuminuria no es una prueba de rutina en el laboratorio clínico. Sin embargo, el método semicuantitativo más utilizado es el de la cinta reactiva y como métodos cuantitativos, suele usarse el inmunoturbidimétrico o el método de Elisa fase sólida Nycocard. Debido a que estos métodos son los más aplicados en el laboratorio clínico, las investigadoras se plantearon comparar los resultados del método inmunoturbidimétrico, el método Elisa fase sólida Nycocard y el método de la cinta reactiva, para la determinación de microalbuminuria utilizando diferentes concentraciones conocidas de albúmina.

Materiales y Métodos

El trabajo de investigación está enmarcado en un diseño no Experimental de tipo transeccional; ya que las variables no fueron manipuladas, se observó el evento tal y como ocurrió en su contexto original y la recolección de los datos se realizó en un momento único para su procesamiento. Es descriptivo, porque los datos recolectados mostraron un fenómeno que ocurrió con la mayor precisión posible. (12,13).

En la presente investigación se describió el comportamiento de tres métodos para la determinación de la microalbuminuria utilizando para ello diversas concentraciones conocidas de albúmina, de modo de dilucidar cuál de los métodos utilizados fue el más preciso, exacto y confiable para la determinación de dicho parámetro.

A partir de una solución madre de albúmina al 20%, se prepararon patrones de 3, 7, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125 y 150 mg/L, los cuales conformaron la población y muestra de este estudio, para así poder realizar la comparación entre los métodos objetos de la presente investigación.

Se obtuvo una muestra de orina parcial matutina, a la cual se le midió la densidad y el pH con las cintas para análisis de orina ComburTest. Se llevó a pH neutro con NaOH al 10% y se centrifugó la muestra, debido a que estas son condiciones señaladas por la casa fabricante como tratamiento previo de la muestra para la ejecución de las técnicas. A partir del reactivo de albúmina concentrado, se calcularon los volúmenes a medir y se prepararon soluciones de 3, 7, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125 y 150 mg/L, utilizando el sobrenadante de la orina previamente centrifugada. Dichos rangos abarcaron los valores inferiores, medios y superiores a los establecidos por las técnicas ejecutadas para la determinación de microalbuminuria, una vez obtenidas las diversas soluciones de concentración conocida, se procedió a tomar tres alícuotas de cada una, y se les determinó el valor de la microalbuminuria por la cinta reactiva, por el método turbilátex y por el método Elisa fase sólida Nycocard.

Para el método inmunoturbidimétrico, se estandarizó la técnica, el reactivo de trabajo y todos los ensayos de las soluciones fueron ejecutado a temperatura ambiente siguiendo el protocolo indicado en el inserto del kit de marca Spinread turbilátex. La longitud de onda utilizada fue 545nm – 600nm la cual fue medida en un fotocolorímetro Stat fax milleniun III.

En cuanto a la medición con la cinta reactiva, se siguió el procedimiento indicado por la casa comercial Micraltest, en el cual se sumergía la cinta por 5 segundos y realizaba la lectura luego de transcurrido el minuto exacto, no más de cinco minutos. Posterior a esto se comparó la coloración obtenida con la cartilla de colores que indican las concentraciones específicas señaladas por el fabricante las cuales corresponden a 20, 50 y 100 mg/L.

Posteriormente se procedió a realizar las determinaciones con el método inmunológico en fase sólida de tipo sándwich, donde cada uno de los patrones preparados fué medido en un densitómetro fotocolorímetro Nycocard Reader II.

Estas técnicas se realizaron en el Laboratorio de Investigación y Postgrado de la Escuela de Bioanálisis (LIPEB).

Determinación de Microalbuminuria por el método Turbilátex.

Fundamento: Es un ensayo turbidimétrico para la cuantificación de microalbúmina en orina humana. Las partículas de látex recubiertas con anticuerpos anti-albúmina humana, son aglutinadas por la microalbúmina presente en la muestra del paciente. El proceso de aglutinación provoca un cambio de absorbancia proporcional a la concentración de microalbúmina de la muestra y por comparación con un calibrador de albúmina de concentración conocida se puede determinar el contenido de microalbúmina en la muestra ensayada.

Valores de Referencia: hasta 15 mg/L.

Determinación de Microalbuminuria por el método de la Cinta Reactiva.

Fundamento: Al impregnar la cinta con la orina, la albúmina presente en la muestra se combina con un conjugado soluble de antialbúmina-galactosidasa, el cual se haya fijo en la cinta. El complejo albúmina- anticuerpo- galactosidasa y el exceso del conjugado se dejan eluir en un área que contiene albúmina fijada, donde se captura el exceso de conjugado. Este complejo pasa posteriormente a una almohadilla que contiene el sustrato, donde la galactosidasa reacciona con el rojo de clorofenol, provocando un cambio de color que va desde amarillo hasta rojo. Posterior a la incubación a temperatura ambiente, se compara el color de la cinta con la cartilla de colores que provee el producto. Estos colores se corresponden a concentraciones de 0, 20, 50, y 100 mg/L, los cuales proveen una estimación semicuantitativa de la concentración de albúmina.

Valores de Referencia: entre 0-20 mg/L.

Determinación de Microalbuminuria por el método Elisa fase sólida NycoCard.

Fundamento: Es un test inmunológico en fase sólida de tipo sándwich. La placa test contiene una membrana recubierta de anticuerpos monoclonales inmovilizados específicos de la albúmina. Cuando la muestra diluida se deposita sobre la placa test, los anticuerpos inmovilizados sobre la membrana capturan las moléculas de albúmina contenidas en la muestra. La albúmina se une por una reacción tipo sándwich a los anticuerpos marcados conjugados impregnados en la membrana. El exceso de conjugado es eliminado de la membrana con una solución de lavado. El filtro de papel situado sobre la membrana absorbe el exceso de líquido. Las partículas de oro unidas provocan una coloración de la membrana, la intensidad de coloración es proporcional a la concentración de albúmina en la muestra. Esta intensidad es medida cuantitativamente con la ayuda de un densitómetro colorimétrico Nyco Card reader II.

Valores Normales < 20mg/L

Rango de medida es entre 5 – 200 mg/L. Intervalo de medida de 1 mg/L

Análisis y Discusión

Una vez preparados los patrones con las concentraciones de 3, 7, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125 y 150 mg/L, se procedió a realizar la determinación de la Microalbuminuria por las técnicas mencionadas. Para el método inmunoturbidimétrico, se estandarizó la técnica y se siguió el protocolo indicado en el inserto del kit marca Spinread, cuya lectura se realizó en un fotocolorímetro (Stat fax Milleniun III) a la longitud de onda indicada. Con relación a la cinta reactiva Micraltest, se midieron todos y cada uno de los patrones preparados comparando el color obtenido en la cinta con la cartilla de colores provisto por el producto, cuyas concentraciones corresponden a 20, 50 y 100 mg/L. Posteriormente se procedió a realizar las determinaciones con el método inmunológico en fase sólida de tipo sándwich los cuales fueron medidos en un densitómetro fotocolorímetro Nycocard Reader II. A continuación se presentan los resultados.

Tabla Nº 1. Concentración de Microalbuminuria a través del método Inmunoturbidimétrico 

metodos_determinacion_albuminuria/concentracion_microalbuminuria_inmunoturbidimetria

Fuente: Datos obtenidos en el presente estudio (2009)



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